细胞描述

BG01V是一株具有异常核型的人类胚胎干细胞系。尽管有异常的核型（49, XXY, +12, +17），但当在小鼠胚胎饲养层（MEFs）上生长时，这些克隆状仍显示出均匀的形态，可预测生长速率，并且在培养中易于维持。据报道，细胞的多能性标记和碱性磷酸酶活性呈阳性。目前代数为P23左右，我库使用的饲养层为CF-1 MEF ( SCSP-105C 、 SCSP-105R 或 SCSP-110R )

细胞特性

1） 来源：人 内细胞团

2） 形态：球形克隆 贴壁生长

3） 含量：>1x10^6  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5） 用途：仅供科研使用

运输和保存

干冰运输：1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

一．培养基及培养冻存条件准备

1）准备DMEM/F12 基础培养基                  (iCell-0005)                  77 %（389mL）      

Knockout Serum Replacement               （Invitrogen, 10828）         20%（100mL）
GlutaMAX-1谷氨酰胺                                    (iCell-0900)                 1%（5mL）

MEM NEAA非必需氨基酸                            (iCell-01000)               1%（5mL）

55mM β-巯基乙醇                                            (iCell-8211)                1.25mL

bFGF生长因子                                              （iCell-C0468）            4ng/mL（2.0μg）

注意：

1、建议使用CF-1 MEF 作为饲养层细胞。

2、在铺BG01V人胚胎干细胞前，需对MEF进行处理，具体处理步骤见下文丝裂霉素灭活MEF。

3、该细胞建议冻存干冰发货，不适合长时间活细胞运输，会影响细胞活力。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：完全培养液 20%%，FBS 60%%，DMSO 20%%现用现配。

我库冻存时，体积为 500 μl，预期存活率 70%，每支冻存管的细胞复苏，3 至4 天后，会形成 30 至 40 个克隆，建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。

二：细胞处理

丝裂霉素灭活MEF

待MEF细胞密度达到80%以上，加入含丝裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培养液，置于37培养箱中孵育2.5h，2.5h后，弃掉培养液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培养基，备用，当天2h后或者第二天可以传入BG01V人胚胎干细胞。

复苏：

1.将BG01V人胚胎干细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml BG01V人胚胎干细胞完全培养液的 15ml 离心管内，以 1000 rpm，离心 5 min。

3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的BG01V人胚胎干细胞完全培养液 2 ml，吹打悬浮。

4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。

5.  转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。

6. 每天更换BG01V人胚胎干细胞完全培养液。

传代：

1.一般在复苏后第 2-3天传代，视克隆大小和密度而定。

2. 吸除废液。

3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于 37℃培养箱内消化细胞。

5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml BG01V人胚胎干细胞完全培养液终止消化。

7.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清。

8. 加入约1ml BG01V人胚胎干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞， 制成单细胞悬液。

9. 加入足量的BG01V人胚胎干细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地，一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。传代周期：5-7天，传代比例：1:3-1:4，每天换液。

冻存：

1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。

2. 以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。

3.按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

4.将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：

BG01V人胚胎干细胞完全培养液 20%，FBS 60%，DMSO 20%

附：BG01V人胚胎干细胞与 MEF 细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：

1.培养中的BG01V人胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前复温好的BG01V人胚胎干细胞完全培养液重悬细胞， 吹打混匀，细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25 培养瓶中培养的BG01V人胚胎干细胞，在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离BG01V人胚胎干细胞与 MEF 细胞）中。

2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。

3. 1小时后，绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分BG01V人胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液，进行后续实验。